Real-time imaging of nitric oxide (NO) signals derived from differentially targeted endothelial nitric oxide synthases (eNOS) using genetically encoded biosensors

Abstract

Nitrik oksit (NO), makrofaj, nöron ve endotel hücreleri dahil birçok farklı hücre tiplerinde üretilen gaz halindeki bir moleküldür. Endotelyal hücrelerde NO, düz kas hücrelerinin gevşemesini ve vasküler tonunun düzenlediği bilinen kalsiyum bağımlı endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) tarafından üretilir. Fizyolojik koşullarda, eNOS hücre zarındaki kaveolada lokalizedir genellikle protein-protein etkileşimleri nedeniyle aktif değildir. eNOS’un hücre içi farklı bölmeleri arasındaki translokasyonun NO üretimini etkileyebileceği de gösterilmiştir. Bununla birlikte, literatürdeki ilgili çalışmaların çoğunda, uygun araçların bulunmaması nedeniyle lokal eNOS kaynaklı NO biyoyararlanımı araştırılamamıştır. Bu diploma tezinde NO ve Ca2+ için yeni multispektral görüntüleme tekniklerinden yararlanılarak bu konu gözden geçirilmiştir. Bu amaçla, yüksek mekân-zamansal çözünürlük ve yüksek seçicilik ile canlı hücrelerde NO tespiti sağlayan yeni genetik olarak kodlanmış NO sensörü (geNOps) kullanılmıştır. Lokal Ca2+ sinyallerinin görselleştirilebilmesi için GECO' ların kırmızı ve farklı hedefli varyantları kullanılmıştır. Farklı hücresel lokallerde eNOS aktivitesini incelemek için HEK293 hücreleri model sistem olarak kullanılarak yabani tip (wild type)-eNOS ile nükleer hedefli eNOS karşılaştırılmıştır. Her iki bölmede de eNOS’un aktivasyonu için gerekli olan Ca2+ sinyalleri tespit edilmiştir. Bu yaklaşım, çekirdekteki eNOS aktivitesinin, aynı deney koşulları altında yabani tip-eNOS'a kıyasla önemli ölçüde azaldığını, ancak yine de aktif olduğunu açıkça gösterilmiştir. Bu tezde, farklı hücre içi lokallerdeki eNOS aktivitesi farklılıklarını ortaya çıkarmak amacıyla multispektral görüntüleme tekniklerinden yaralanılmıştır ve lokal Ca2+ ortamının eNOS aktivitesindeki farklılıkları etkilemediği ilk kez, doğrudan kanıtlanmıştır.

Nitric oxide (NO) is a gaseous molecule produced in many different cell types, including macrophages, neurons, and endothelial cells. In endothelial cells, NO is produced by the calcium-dependent endothelial nitric oxide synthase (eNOS), which is known to regulate smooth muscle cell relaxation and vascular tone. Under physiological conditions, eNOS is localized to the caveolae in the cell membrane and is generally inactive due to protein-protein interactions. It has also been shown that translocation between different compartments of eNOS inside the cell can affect NO production. However, in most of these studies the local eNOS derived NO bioavailability could not be studied due to the lack of proper tools. In this diploma, issue by exploiting novel multispectral imaging techniques for NO and Ca2+ was revisited. For this purpose, the novel genetically encoded NO sensor (geNOps), which provides NO detection in living cells with high-spatial and temporal resolution and high selectivity, was used. To visualize local Ca2+signals the well-established redshifted and differentially targeted variants of the GECOs was exploited. To study eNOS activity in different cellular locales, HEK293 cells was used as a model system and compared wild type-eNOS versus nuclear-targeted eNOS. In both compartments, Ca2+ signals required for eNOS activation was detected upon stimulation. This approach clearly showed that eNOS activity in the nucleus is significantly reduced but still active compared to the wild type-eNOS under the same experimental conditions. In this master thesis, multispectral imaging techniques was used to unveil differences in eNOS activity in different subcellular locales. This master thesis provided for the first-time direct evidence that the local Ca2+ environment does not dictate differences in endothelial nitric oxide synthase activity.